一、概述
蛋白质是生命的物质基础，是构成生物细胞的重要成分，是生物体生长发育和修补的原料。体内酸碱平衡的维持、遗传信息的传递、物质代谢及转运都与蛋白质有关。体内缺乏蛋白质，会导致生长缓慢或停滞，不能维持生命活动。
蛋白质是食品中重要的营养指标，各种食品的蛋白质含量不同，例如，牛肉中蛋白质含量为20.1％，猪肉9.5％，兔肉21.2％，鸡肉21.5％，牛乳3.3％，黄鱼17.0％，带鱼18.1％，大豆36.3％，稻米8.3％，小麦粉(标准)9.9％，菠菜2.4％，黄瓜、桃0.8％，柑橘0.9％，苹果0.4%。测定食品中蛋白质含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制都具有极其重要的意义。
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是测定总氮最准确和最简便的方法之一。测定食品总氮量，再乘以蛋白质的换算系数得到蛋白质总量。由于测得的蛋白质除纯蛋白质外，还有其它含氮物质，故称之为粗蛋白质。此外，双缩脲分光光度法、染料结合分光光度法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定。近年来，国外采用红外检测仪，利用一定的波长范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收和反射的特性，而建立了近红外光谱快速定量法。
二、食品中蛋白质的测定
(一)凯氏定氮法
凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机氮总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也GB中唯一的标准方法，由于该法是丹麦人道尔(J.Kjeldah)于1883年提出用于测定研究蛋白质而得名。
常用的方法是将蛋白质消化，测定其总氮量，再换算成为蛋白质含量的凯氏定氮法。食品中的含氮物质，除蛋白质外，还有少量的非蛋白质含氮物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。
不同的蛋白质其氨基酸组成及方式不同，所以各种不同来源的蛋白质，其氮量也不相同，一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮素相当于6.25份蛋白质，此系数称为蛋白质换算系数。食品不同，蛋白质组成也不同，蛋白质换算系数也有差异。
凯氏定氮法有常量法、微量法及改良微量法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添量不同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。
有些样品中含有难以分解的含氮化合物，如：蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作催化剂，18h或更长时间也难经分解，单独用汞化合物，在短时间内即可，但它有毒性。
微量凯氏定氮法与常量法相比，不仅可节省试剂和缩短实验时间，而且准确度也较高，在实际工作中应用更为普遍。下面主要介绍微量凯氏定氮法。
1. 原理
食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中碳、氢形成CO2及H2O逸去，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵保留在溶液中。将消化液碱化、蒸馏，使氨游离，随水蒸气蒸出，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定所生成的硼酸铵，根据酸的消耗量，计算出总氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。测定过程分为三个阶段，反应式如下：
(1) 消化
2CH3—CH—COOH + 13H2SO4= (NH4)2SO4 + 6CO2↑ + 12SO2↑ + 16H2O
∣
NH2
(2) 碱化、蒸馏与吸收
(NH4)2SO4+ 2NaOH = 2NH3↑ + Na2SO4 + 2H2O
2NH3 + 2H3BO3= (NH4)2B4O7 + 5H2O
(3) 滴定
(NH4)2B4O7+ HCl +5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
2. 仪器
(1) 凯氏烧瓶 (100mL)。
(2) 定氮蒸馏装置：如图5-11。
3. 试剂
(1) 硫酸铜 (CuSO4·5H2O)。
(2) 硫酸钾。
(3) 硫酸 (密度为1.8419g/L)。
(4) 硼酸溶液 (20g/L)。
(5) 混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 (1g/L) 与5份溴甲酚绿乙醇溶液 (1g/L) 临用时混合。(也可用2份甲基红乙醇溶液(1g/L)与1份次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)临用时混合)。
(6) 氢氧化钠溶液 (400g/L)。
(7)硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]或盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=0.0500mol/L]。
4. 操作方法
(1) 样品处理：称取0.20~2.00g固体样品或2.00~5.00g半固体样品或吸取10.00~25.00mL液体样品 (约相当氮30~40mg)，移入干燥的100mL或500mL凯氏定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5~1h取下放冷，用少量水转移入100mL容量瓶中，并用少量水洗凯氏定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
(2) 测定：按图5-11装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水约至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
(3) 向接收瓶内加入20mL硼酸溶液(20g/L)及1~2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，准确吸取10mL样品处理液由小玻杯流入反应室，并以少量水洗涤小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10mL氢氧化钠溶液(400g/L)倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，当冷凝管流出第一滴馏出液开始，计时蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0.05mol/L)滴定至灰紫色或蓝紫色为终点。同时吸取10mL试剂空白消化液按上述步骤操作进行空白试验。
5. 计算
式中：X—样品中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL；
V1—样品消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；
V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；
c—硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；
0.0140—1.0mL硫酸 [c(1/2H2SO4)=1.000mol/L]或盐酸[c(HCl)=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，g；
m—样品的质量或体积，g或mL；
F—氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。
6.说明
(1) 所用试剂要用无氨蒸馏水配制。
(2) 样品消化应在通风橱内进行。
(3) 消化过程中应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝的酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。
(4) 样品消化时，如泡沫太多，可加少量辛醇或液体石醋去泡，防止样品溢出。
(5) 样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入过氧化氢2~3 mL后再加热。
(6) 为了加速氧化分解，常用催化剂是硫酸铜，有时也选用硒粉。硫酸铜也是蒸馏时样品碱化的指示剂。
(7) 消化时硫酸与硫酸钾作用生成硫酸氢钾，可提高沸点(硫酸沸点为330℃，添加硫酸钾后可达400℃)，加快消化速度。
(8) 蒸馏装置要密闭不漏气，严防氨逸出。蒸馏过程中不得中途间断，以免样品液发生倒吸。
(9 )操作过程中要严防酸、碱污染硼酸吸收液，否则会造成较大的测定误差。
(二)双缩脲法
双缩脲法是生物化学领域测定蛋白质浓度常用的方法之一，可用于米谷类、油料及豆类等样品中蛋白质含量测定，该方法操作简单快捷，但灵敏度较低。
1. 原理
当脲(尿素)被加热至150~180℃时，两分子脲缩合脱去一个氨分子而形成双缩脲，在碱性条件下，能与硫酸铜生成紫红色络合物 (双缩脲反应)。由于蛋白质分子中含有肽键(—CO—NH—)，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，在560nm最大吸收波长条件下，可用来进行蛋白质的定量。
2. 仪器
(1) 恒温水浴锅。
(2) 分光光度计。
(3) 离心机(转速4000r/min)。
3. 试剂
(1) 碱性硫酸铜溶液：将10mL10mol/L氢氧化钾溶液和20mL25%酒石酸钾钠溶液加到930mL蒸馏水中，剧烈搅拌(避免生成氢氧化铜沉淀)，同时慢慢加入40mL4%的硫酸铜溶液。
(2) 四氯化碳。
4. 操作方法
(1) 标准曲线的绘制：以用凯氏定氮法测出的蛋白质含量的样品作为标样，按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样品于8支50mL比色管中，各加入1mL四氯化碳，用碱性硫酸铜溶液定容至50mL，振摇10min后，静置1h。取上层清液离心5min，离心分离后的透明液移入比色皿中，在560nm波长下，以蒸馏水作参比液，测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(2) 样品的测定：准确称取适量样品，(蛋白质含量40~110mg)于50mL纳氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度，在标准曲线上即可查得样品蛋白质的毫克数。
5. 计算
式中：X—样品中蛋白质含量，mg/100g；
C—由标准曲线上查得的蛋白质含量，mg；
m—样品质量，g。
6. 说明
(1) 含脂肪高的样品应预先用乙醚除去。
(2) 样品含不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，可预先将蛋白质抽出后再进行测定。
(3) 当肽链中有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。
三、氨基酸态氮的测定
(一)双指示剂甲醛滴定法
1. 原理
氨基酸含有氨基和羧基两性基团，他们相互作用形成中性的内盐，加入甲醛溶液后，与氨基反应，使酸性的羧基游离出来，再用氢氧化钠标准溶液滴定羧基，可间接测出氨基酸的含量。
2. 试剂
(1) 40%中性甲醛溶液：用百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠溶液中和至淡蓝色。
(2) 百里酚酞95%乙醇溶液 (1g/L)。
(3) 氢氧化钠溶液 (0.1mol/L)。
(4) 中性红50%乙醇溶液 (1g/L)。
3. 操作方法
移取含氨基酸约20~30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中一份加3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至琥珀色为终点；另一份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛溶液10mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。
4. 计算
式中：X—氨基酸态氮的含量，g/100g；
V1—用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
V2—用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
c—氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L
m—测定用样品溶液相当于样品的质量，g
0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol。
(二)电位滴定法
1. 原理
根据氨基酸的两性作用，加入甲醛固定氨基的碱性，使溶液显示羧基的酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。
2. 仪器
(1) 酸度计。
(2) 磁力搅拌器。
(3) 微量滴定管 (10mL)。
3. 试剂
(1) 20%中性甲醛溶液。
(2) 氢氧化钠标准溶液 (0.05mol/L)。
4. 操作方法
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